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Engenharia genética/Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria: diferenças entre revisões

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[[Imagem:PCR tubes.png|thumb|right|150px|Conjunto de oito tubos de PCR, cada um contendo 100μL.]]
 
* Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos ''eppendorf'' marcados, fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 μL de Taq e 900 μL do tampão de diluição 1X e depois 5X (200 μLμL →→ 800 μLμL);
 
* Fazer 3 diluições sucessivas de 2X em 3 tubos ''eppendorf'' marcados, a partir de 500 μLμL da diluição de 1000X e 500 μLμL de tampão de diluição 1X;
 
* Colocar 20 μLμL das diluições em diferentes tubos de PCR: 10x, 50x, 100x, 200x e 400x (5 tubos);
 
* Adicionar 20 μLμL de PCR ''MasterMix'' a cada tubo de PCR;
 
* Colocar os tubos em gelo;
 
[[Imagem:Serial Dilution (to PCR).jpg|thumb|centre|900px|Preparação de soluções de DNA polimerase com diferentes concentrações, através da técnica de diluições seriais, para amplificação em PCR. Os factores de diluição correspondentes a cada solução estão representados nos rótulos dos respectivos eppendorfs. Pipetaram-se 100μL da solução inicial (1x) para o 1º eppendorf e adicionaram-se 900μL de Tampão de Diluição. Agitar a solução. Desta solução (10x) pipetaram-se 200μL para o 2º eppendorf e adicionaram-se 800μL de Tampão de Diluição. E assim sucessivamente, como descrito na figura, sempre de modo a perfazer 1mL de volume final no eppendorf. De todos esses eppendorfs retiraram-se 20μL aos quais se adicionou igual volume de Mastermix. Agitar as soluções. Inserir no termociclador, para realizar o PCR.]]
 
 
* Depois de agitadas no ''vortex'', as misturas são sujeitas a PCR de acordo com as condições especificadas na
tabela abaixo.
 
 
== Condições do PCR ==
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| '''Temperatura'''|| '''Duração'''|| '''Fase'''
|-
| 94 º°C|| 120 seg || Desnaturação inicial
|-
| 94 º°C|| 20 seg || Desnaturação
|-
| 40 º°C|| 20 seg|| Emparelhamento
|-
| 72 º°C|| '''Taq''' = 20 seg e '''Pfu'''= 1 min 45 seg|| Elongamento
|-
| 72 º°C|| 120 seg|| Elongamento final
|}
 
Esta sequência é repetida 30 vezes.
 
 
 
== Análise Electroforética dos produtos de PCR ==
 
* Misturar 5 μLμL de produto de PCR com 5 μLμL de tampão de aplicação;
 
* Aplicar as amostras num [http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel gel de agarose] 0,8%;
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[[Imagem:Agarose-Gelelektrophorese.png|thumb|right|400px|Representação esquemática do processo de electroforese, detalhando as sucessivas etapas. (1) Gel de agarose com três poços. (2) Injecção da solução padrão de DNA marcadora de pesos moleculares, no primeiro poço. (3) Após o padrão estar injectado, injectam-se as amostras no segundo e terceiro poços. (4) Aplica-se uma corrente eléctrica que provoca a migração do DNA para o pólo positivo, devido à carga negativa conferida pelo esqueleto fosfatado. (5) As cadeias de DNA pequenas migram mais rapidamente, por outro lado, as maiores migram mais lentamente através do gel; normalmente, durante este processo, o DNA não é visível, por isso adiciona-se ao DNA um corante ou marcador para evitar que o DNA migre para fora do gel. (6) Adicionar o corante ou marcador também ao padrão de DNA.]]
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
== Actividades propostas ==
Linha 80 ⟶ 64:
 
* Calcular o número de unidades na preparação.
 
 
 
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