Diferenças entre edições de "Engenharia genética/Desenho dos primers"

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}}
 
 
== Objectivo ==
 
== Conhecer o Vector pUG35 ==
 
 
==== Encontrar a sequência nucleotídica do vector pUG35 ====
 
| || note|| derived from Saccharomyces cerevisiae
|}
 
 
{| border |- '''gene'''
| || note|| from CYC1
|}
 
 
{| border |- '''gene'''
|'''rep_origin''' || 3882..3954 || (Início da sequência)
|}
 
 
* De seguida, encontra-se a sequência completa do vector pUG35.
601 gtaagtagca tcaccttcac cttcaccgga gacagaaaat ttgtgaccat taacatcacc
661 atctaattca accaaaattg ggacaacacc agtgaataat tcttcacctt tagacat
 
 
* As duas cadeias do DNA, denominam-se ''Watson'' e ''Crick'':
 
No entanto, na sequência obtida para o gene GFP, só vemos a cadeia ''Crick''.
 
 
* '''Nota''': A sequência codificante (CDS) deve começar com “atg” (codão '''''start''''') e acabar com ”'''taa'''” (codão '''''stop''''').
 
Como pode observar, a sequência apresentada é a da cadeia complementar, de modo que o codão '''''start''''' está na base (cat ⇒ atg) e o codão '''''stop''''' está no topo (tta ⇒ taa).
 
 
 
== Construir os ''primers'' para amplificar o gene GFP ==
 
'''''Primer Reverse''''': 5' - TTA TTT GTA CAA TTC ATC CAT ACC A - 3'
 
 
Explicação:
 
'''''Primer Reverse''''' ------------------------------------------------------------------ ''3' - A CCA TAC CTA CTT AAC ATG TTT ATT - 5'''
 
 
'''''Primer Forward''''' ---------------- ''5' - ATG TCT AAA GGT GAA GAA TTA TTC A - 3'''
 
cadeia molde complementar - '''3' - TAC AGA TTT CCA CTT CTT AAT AAG TGA ... GTA CCA TAC CTA CTT AAC ATG TTT ATT - 5''''
 
 
 
== Propriedades dos ''primers'' construídos para amplificar o gene GFP ==
 
* Pretende-se que os ''primers'' tenham uma T<sub>m</sub> (''melting temperature'') de 49-51 º°C.
 
* Pretende-se que os ''primers'' tenham uma T<sub>m</sub> (''melting temperature'') de 49-51 ºC.
 
Utilizando o programa [http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html Oligonucleotide properties calulator] pode calcular a T<sub>m</sub> automaticamente.
'''Nota:'''
Ambas as equações assumem que o Emparelhamento ocorre nas condições padrão de 50 nM ''primer'', 50 mM Na<sup>+</sup> e pH 7.0.
 
 
==== Propriedades correspondentes aos ''primers Forward e Reverse'', quanto à temperatura média de desnaturação (T<sub>m</sub>), ao tamanho da sequência (quantidade de nucleótidos) e à percentagem de guaninas e citosinas (% GC). ====
| '''''Primer'''''|| '''''Forward'''''|| '''''Reverse'''''
|-
| '''T<sub>m</sub>''' (Basic)|| 49 º°C|| 49 º°C
|-
| '''Tamanho'''|| 25 nucleótidos|| 25 nucleótidos
|}
</center>
 
 
 
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