Engenharia genética/Desenho dos primers: diferenças entre revisões
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[[Engenharia Genética:Transformação e Gap-Repair em Saccharomyces cerevisiae|Transformação e Gap-Repair em ''Saccharomyces cerevisiae'']]
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== Objectivo ==
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== Conhecer o Vector pUG35 ==
==== Encontrar a sequência nucleotídica do vector pUG35 ====
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| || note|| derived from Saccharomyces cerevisiae
|}
{| border |- '''gene'''
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| || note|| from CYC1
|}
{| border |- '''gene'''
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|'''rep_origin''' || 3882..3954 || (Início da sequência)
|}
* De seguida, encontra-se a sequência completa do vector pUG35.
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601 gtaagtagca tcaccttcac cttcaccgga gacagaaaat ttgtgaccat taacatcacc
661 atctaattca accaaaattg ggacaacacc agtgaataat tcttcacctt tagacat
* As duas cadeias do DNA, denominam-se ''Watson'' e ''Crick'':
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No entanto, na sequência obtida para o gene GFP, só vemos a cadeia ''Crick''.
* '''Nota''': A sequência codificante (CDS) deve começar com “atg” (codão '''''start''''') e acabar com ”'''taa'''” (codão '''''stop''''').
Como pode observar, a sequência apresentada é a da cadeia complementar, de modo que o codão '''''start''''' está na base (cat
== Construir os ''primers'' para amplificar o gene GFP ==
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'''''Primer Reverse''''': 5' - TTA TTT GTA CAA TTC ATC CAT ACC A - 3'
Explicação:
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'''''Primer Reverse''''' ------------------------------------------------------------------ ''3' - A CCA TAC CTA CTT AAC ATG TTT ATT - 5'''
'''''Primer Forward''''' ---------------- ''5' - ATG TCT AAA GGT GAA GAA TTA TTC A - 3'''
cadeia molde complementar - '''3' - TAC AGA TTT CCA CTT CTT AAT AAG TGA ... GTA CCA TAC CTA CTT AAC ATG TTT ATT - 5''''
== Propriedades dos ''primers'' construídos para amplificar o gene GFP ==
▲* Pretende-se que os ''primers'' tenham uma T<sub>m</sub> (''melting temperature'') de 49-51 ºC.
Utilizando o programa [http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html Oligonucleotide properties calulator] pode calcular a T<sub>m</sub> automaticamente.
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'''Nota:'''
Ambas as equações assumem que o Emparelhamento ocorre nas condições padrão de 50 nM ''primer'', 50 mM Na<sup>+</sup> e pH 7.0.
==== Propriedades correspondentes aos ''primers Forward e Reverse'', quanto à temperatura média de desnaturação (T<sub>m</sub>), ao tamanho da sequência (quantidade de nucleótidos) e à percentagem de guaninas e citosinas (% GC). ====
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| '''''Primer'''''|| '''''Forward'''''|| '''''Reverse'''''
|-
| '''T<sub>m</sub>''' (Basic)|| 49
|-
| '''Tamanho'''|| 25 nucleótidos|| 25 nucleótidos
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|}
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