Bioquímica/Cinética enzimática: diferenças entre revisões

O estudo da função de enzimas envolve uma aproximação multidisciplinar. Por um lado, a determinação da estrutura, usando técnicas espectroscópicas como a difracçãodifração de raios-X em proteínas cristalizadas ou a ressonância magnética nuclear (RMN) em proteínas em solução, permite localizar a posição dos diferentes resíduos no espaço. Este tipo de estudo revela muitas vezes detalhes sobre o mecanismo da reacçãoreação, ou seja, a forma e sequência de ligações do substrato ao centro activoativo para ser catalisado. Por outro lado, é importante conhecer parâmetros cinéticos, como a velocidade da reacçãoreação catalisada, o efeito de inibidores nessa velocidade, quantas moléculas a enzima consegue catalisar por segundo, etc, para poder ser aferida a eficiência dessa enzima e a forma como é regulada.

== Progressão da reacçãoreação ==

Para que uma reacçãoreação enzimática se dê, a enzima (E) e o substrato (S) têm de se encontrar e formar o '''complexo enzima-substrato''' (ES). Como referido anteriormente, embora este possa parecer um formalismo, a formação deste complexo é uma peça chave na compreensão da progressão de uma catálise. O complexo ES é lábil: a enzima pode dissociar-se do seu substrato sem ter havido reacçãoreação. Este equilíbrio é expresso sob a forma:

A reacçãoreação de formação de ES é normalmente mais rápida que a reacçãoreação de dissociação de EP, ou seja, a libertação do produto da reacçãoreação é normalmente um '''passo limitante''' da reacçãoreação.

O estudo de uma reacçãoreação enzimática ''in vitro'' não reflectereflete a verdadeira situação das enzimas em células, mas possibilita a simplificação da determinação de parâmetros cinéticos. Dentro de uma célula, o substrato pode estar confinado a um dado compartimento e não sofrer facilmente difusão: por exemplo, pode ser o produto de uma reacçãoreação anterior numa via metabólica, pelo que passa directamentediretamente de uma enzima para a outra. Normalmente, os estudos ''in vitro'' usam uma concentração de substrato muito superior à concentração de enzima, para que a probabilidade de uma enzima encontrar uma molécula de substrato seja o mais elevada possível.

[[Imagem:Michaelis-Menten.png|thumb|300px|Representação da variação da velocidade inicial da reacçãoreação (V) em função da concentração de substrato ([S]).]]

Outra vantagem do uso de uma concentração de substrato ([S]) maior que a concentração de enzima ([E]) é a possibilidade de monitorizar a variação da velocidade de reacçãoreação com [E] sem que haja uma variação apreciável de [S]. Como S está a ser convertido em P, [S] decresce com o tempo, à medida que o produto se acumula em solução. Como a [S] influencia a formação do complexo ES (e portanto da formação de produto), vai influenciar também a velocidade da reacçãoreação. No entanto, se for feita apenas a monitorização da velocidade inicial da reacçãoreação (tipicamente, durante os primeiros 30 a 60 segundos), a variação de [S] não é significativa e pode ser tomada como constante.

A que se deve este comportamento? A baixas concentrações de substrato, a maior parte da enzima em solução encontra-se na forma livre, E; usando concentrações suficientemente elevadas de S, toda a enzima se encontrará, num dado instante, em complexo com molécula(s) de substrato, isto é, na forma ES. Por maior que seja a concentração de substrato utilizada, as moléculas de enzima não têm capacidade de catalisar o substrato, por todos os centros activosativos se encontrarem ocupados. Nestas condições, diz-se que a enzima se encontra '''saturada'''.

Também é assumido que a concentração de produto é negligível no início da reacçãoreação, logo é negligível a extensão da reacçãoreação inversa no equilíbrio entre substrato e produto, S <math>\leftrightarrows</math> P, considerando-se apenas a reacçãoreação directadireta na dedução da equação. Assim, a reacçãoreação é descrita por

Como já referido, a formação de [ES] limita a velocidade da reacçãoreação, medida como V₀:

Se [ES] fosse facilmente mensurável, o valor de k₂ seria simples de determinar directamentediretamente. No entanto, esse não é o caso, e o valor de [ES] tem de ser deduzido. Para tal, considere-se que a concentração do total de enzima presente na reacçãoreação, [E]_t, é o somatório da concentração de enzima em complexo com o substrato, [ES], e da concentração de enzima "livre" (não ligada a substrato), [E]_l:

Embora o gráfico obtido directamentediretamente da equação de Michaelis-Menten seja de interpretação relativamente simples, existem tratamentos matemáticos que simplificam a representação gráfica da equação e permitem a obtenção rápida de parâmetros cinéticos.

O tratamento mais conhecido e porventura mais utilizado é o de '''Lineweaver-Burk'''. A equação de Michaelis-Menten pode ser transformada numa equação da rectareta, do tipo y=ax+b:

Esta última forma da equação de Michaelis-Menten é conhecida como '''equação de Lineweaver-Burk'''. Um gráfico de <math>\frac{1}{V_o}</math> (y) em função de <math>\frac{1}{[S]}</math> (x) é uma rectareta de declive igual a <math>\frac{K_M}{V_max}</math> (a), que intercepta o eixo das coordenadas na origem no ponto <math>\frac{1}{V_max}</math> (b), interceptando também o eixo das abcissas no ponto <math>\frac{-1}{K_M}.</math> Este gráfico é também chamado '''duplo recíproco''' pois trata-se de uma representação gráfica do recíproco de ambos os parâmetros V_o e [S].

Outra vantagem na utilização da equação de Lineweaver-Burk é visível em estudos de inibição enzimática, sendo relativamente simples de detectar e distinguir entre diferentes tipos de inibição: ao usar diferentes concentrações de inibidores, e consoante o tipo de inibição efectuadaefetuada, o gráfico de Lineweaver-Burk muda de uma forma bem estudada, como será mais claro no capítulo sobre inibição enzimática.