Diferenças entre edições de "Engenharia genética/Os vetores do sistema pET"

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Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vectores pET. O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes. Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo promotor T7 (do bacteriófago T7) para dirigir a expressão de genes-alvo. Considerando que a RNA polimerase da E. coli não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre transcrição do gene-alvo na ausência duma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efectivamente desacoplado do passo de expressão.
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O hospedeiro mais comummente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as proteases lon and ompT. Recentemente, a Novagen introduziu dois derivados do BL21 para finalidades especiais, dos quais salientamos a série B834 que é um auxotrófico deficiente em metionina e, então, permite elevada actividade específica marcando as proteínas-alvo com 35S-metionina ou selenometionina.
Utilizámos Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.
 
Vantagens do sistema pET:
# Poderoso: níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal; adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.
# Versátil: escolha das tags de fusão em N-terminal e C-terminal para detecção, purificação e localização; Existência de multiple cloning sites expandidas nas três reading frames; Origem de replicação f1 para mutagénese e sequenciação.
# Rápido: Sistemas baseados em E.coli para rápida obtenção de resultados; restriction sites convenientes para subclonagem de outros vectores; escolha de métodos de purificação das proteínas num passo único sem anticorpos.
# Completo: variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio.
 
 
[http://biotech.arl.arizona.edu/education/MCB473/mcb473docs/pET_System.pdf '''pET System Tutorial''' in Novagen 2002–2003 Catalog]
 
 
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