Engenharia genética/Preparação das Taq e Pfu DNA polimerases de Escherichia coli recombinante: diferenças entre revisões
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=== Dia 1 ===
# Inocular 4 mL de meio LB amp com ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;
# Incubar a 37 ºC, com agitação.
=== Dia 2 ===
# Inocular 200 mL de ''SuperBroth'' com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37ºC, com agitação;
# Quando a DO (600nm) ~ 0.4, adicionar 0.4 mL IPTG 1M (concentração final = 2 mM);
# Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37ºC, com agitação.
=== Dia 3 ===
# Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;
# Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
# Eliminar o sobrenadante e ressuspender o ''pellet'' em 5 mL de tampão A;
# Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4ºC);
# Ressuspender as células em 2 mL de tampão A + 20 mg lisozima (concentração final = 4 mg/mL);
# Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;
# Adicionar 2 mL de tampão B com PMSF (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão);
# No gelo, guardar ~0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 1''';
# Incubar a 75 ºC, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;
# Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
# Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos ''eppendorf'';
# Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4ºC);
# Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL;
# No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 2''';
# Misturar com igual volume (~ 4 mL) tampão ''Storage'' com 50 % de glicerol;
# Misturar com igual volume (~ 8 mL) tampão ''Storage'' com 75 % de glicerol;
# O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ~ 8 mL de solução;
# Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 ºC para serem usados na próxima aula prática.
'''''Superbroth''''' (32 g triptona + 20 g extracto de levedura + 5 g NaCl + 5 mL 1N NaOH) / litro
'''Tampão A''': 50 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM dextrose + 1 mM EDTA
'''Tampão B''': 10 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM KCl + 1 mM EDTA + 0.5% Tween 20 (1%) + 1 mM PMSF
'''Tampão Storage''': 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 100 mM NaCl + 0.1 mM EDTA + 0.5 mM DTT + 1% Triton X-100 + 50% / 75% glicerol
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