Diferenças entre edições de "Engenharia genética/Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria"

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1. Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos Eppendorf (marcados 1 a 2), fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 ml Taq e 900 ml de tampão dilution 1X e depois 5X (200 uL800uL).
 
2. Fazer 3 diluições de 2X sucessivas em 3 tubos Eppendorf (marcados 3 a 5) a partir de 500 ml da diluição de 1000X e 500 ml de tampão dilution 1X.
 
3. Adicionar 20 ml das diluições a cada tubo de PCR (10X; 50X; 100X; 200X; 400X) (5 tubos).
 
4. Adicionar 20 ml da PCR Master Mix a cada tubo de PCR
 
6. Colocar os tubos em gelo.
 
7. As misturas, depois de agitadas no vortex, são sujeitas a PCR nas seguintes condições:
 
120 segundos, 94C (desnaturação inicial)
20 segundos, 94C (desnaturação)
20 segundos, 40C (emparelhamento)
20 segundos (Taq) ou 1min 45s (Pfu) , 72C (enlongamento)
120 segundos, 72C (enlongamento final)
 
Esta sequência é repetida 30 vezes
 
8. Durante o tempo de espera, desenhar no computador os primers necessários para amplificar o gene GFP.
 
9. Misturar 5 ml de produto de PCR com 5 ml de tampão de aplicação.
 
10. Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%.
 
11. O instructor irá fazer um gel com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência.
 
12. Correr o gel, durante 20 minutos, a 220 volts.
 
13. Fotografar o gel.
 
14. Comparar o rendimento do PCR com o rendimento obtido com a Taq polímeras comercial.
 
15. Calcular o número de unidades na preparação.
 
1.# Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos Eppendorf''eppendorf'' (marcados (1 ae 2), fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 mlmL de Taq e 900 mlmL dedo tampão dilutionde diluição 1X e depois 5X (200 uL800uLμL → 800μL).;
2.# Fazer 3 diluições sucessivas de 2X sucessivas em 3 tubos Eppendorf''eppendorf'' (marcados (3, a4 e 5) a partir de 500 mlmL da diluição de 1000X e 500 mlmL de tampão dilutionde diluição 1X.;
3.# AdicionarColocar 20 mlmL das diluições aem cadadiferentes tubotubos de PCR: (10X; 50X; 100X; 200X; 400X) (5 tubos).;
4.# Adicionar 20 mlmL dade PCR Master Mix''MasterMix'' a cada tubo de PCR;
6.# Colocar os tubos em gelo.;
7.# As misturas, depoisDepois de agitadas no ''vortex'', as misturas são sujeitas a PCR nasde seguintesacordo com as condições: especificadas na tabela abaixo;
8.# Durante o tempo de espera, desenhar no computador os ''primers'' necessários para amplificar o gene GFP.;
9.# Misturar 5 mlmL de produto de PCR com 5 mlmL de tampão de aplicação.;
10.# Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%.;
11.# O instructorinstrutor irá fazer um gel com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência.;
12.# Correr o gel, durante 20 minutos, a 220 volts.;
13.# Fotografar o gel.;
14.# Comparar o rendimento do PCR com o rendimento obtido com a Taq polímeraspolimerase comercial.;
15.# Calcular o número de unidades na preparação.
 
 
 
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=== Condições do PCR ===
{| border '''Temperatura'''
| '''Temperatura'''|| '''Duração'''|| '''Fase'''
|-
| 94 ºC|| 120 seg || Desnaturação inicial
|-
| 94 ºC|| 20 seg || Desnaturação
|-
| 40 ºC|| 20 seg|| Emparelhamento
|-
| 72 ºC|| '''Taq''' = 20 seg e '''Pfu'''= 1 min 45 seg|| Elongamento
|-
| 72 ºC|| 120 seg|| Elongamento final
|}
 
Esta sequência é repetida 30 vezes. </center>
 
 
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