Engenharia genética/Transformação e gap-repair em Saccharomyces cerevisiae: diferenças entre revisões
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Em condições de assepsia:
# Centrifugar, durante 30 segundos, na velocidade máxima, 2 mL de cultura de levedura colocando 1 mL em cada tubo ''eppendorf'';
# Remover o sobrenadante;
# Ressuspender as células em 1 mL de água desionizada;
# Centrifugar os tubos durante 30 segundos, na velocidade máxima;
# Remover o sobrenadante;
# Adicionar 326 μL de mistura de transformação* a cada tubo, e manter em gelo;
# Adicionar 10 μL de vector a cada tubo;
# Adicionar 24 μL de produto de PCR a um dos tubos ''eppendorf''. Marcar esse tubo com o sinal ('''+''');
# Adicionar 24 μL de água desionizada ao outro tubo ''eppendorf''. Marcar esse tubo com o sinal ('''-''');
# Vortexar ambos os tubos durante 60 segundos, no máximo da velocidade;
# Num banho térmico efectuar um choque térmico a 42 ºC, durante 40 minutos;
# Centrifugar os tubos, durante 30 segundos, na velocidade máxima;
# Remover o sobrenadante;
# Adicionar 1 a 2 mL de água desionizada a cada tubo eppendorf;
# Ressuspender as células;
# Plaquear 200 μL de células de cada tubo em placas marcadas ('''+''') e ('''-''');
# Incubar as placas a 30 ºC.
(*) Mistura de transformação:
240 μL PEG (50%, v/v) + 36 μL 1,0 M acetato de Lítio + 50 μL SS-DNA (2,0 mg/mL)
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