Engenharia genética/Preparação das Taq e Pfu DNA polimerases de Escherichia coli recombinante: diferenças entre revisões

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[[Imagem:E coli at 10000x.jpg|thumb|left|500px|Micrografia electrónica a baixa temperatura de um agregado de bactérias ''E. coli'' (amplificação: 10000X).]]
[[Imagem:Plasmid_replication_(english).svg‎|thumb|right|500px]]
 
 
[[Imagem:E coli.jpg|thumb|right|500px]]]
 
 
=== Dia 1 ===
 
# Inocular 4 mL de [http://en.wikipedia.org/wiki/LB_medium meio LB] amp com ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;
# Incubar a 37 ºC, com agitação.
 
# [http://en.wikipedia.org/wiki/Incubator_%28microbiology%29 Incubar] a 37 ºC, com agitação.
 
 
 
=== Dia 2 ===
 
# Inocular 200 mL de ''SuperBroth'' com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37ºC, com agitação;
 
# Quando a DO[http://en.wikipedia.org/wiki/Optical_density Densidade Óptica] (λ=600nm) ~ ≈0.4, adicionar 0.4 mL [http://en.wikipedia.org/wiki/IPTG IPTG] 1M (concentração final = 2 mM);
 
# Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37ºC, com agitação.
 
 
=== Dia 3 ===
 
# Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;
 
# [http://en.wikipedia.org/wiki/Laboratory_centrifuge Centrifugar] (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
# Eliminar o sobrenadante e ressuspender o ''pellet'' em 5 mL de tampão A;
 
# Eliminar o sobrenadante e ressuspender o [http://en.wikipedia.org/wiki/Pellet ''pellet''] em 5 mL de tampão A;
 
# Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4ºC);
 
# Ressuspender as células em 2 mL de tampão A + 20 mg [http://pt.wikipedia.org/wiki/Lisozima lisozima] (concentração final = 4 mg/mL);
 
# Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;
 
# Adicionar 2 mL de tampão B com [http://en.wikipedia.org/wiki/PMSF PMSF] (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão);
# No gelo, guardar ~0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 1''';
 
# No gelo, guardar ~≈0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 1''';
 
# Incubar a 75 ºC, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;
 
# Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
 
# Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos ''eppendorf'';
 
# Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4ºC);
 
# Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL;
 
# No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 2''';
# Misturar com igual volume (~ 4 mL) tampão ''Storage'' com 50 % de glicerol;
# Misturar com igual volume (~ 8 mL) tampão ''Storage'' com 75 % de glicerol;
# O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ~ 8 mL de solução;
# Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 ºC para serem usados na próxima aula prática.
 
# Misturar com igual volume (~ ≈4 mL) tampão ''Storage'' com 50 % de glicerol;
 
# Misturar com igual volume (~ ≈8 mL) tampão ''Storage'' com 75 % de glicerol;
 
# O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ~ ≈8 mL de solução;
 
# Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 ºC (para serem usadosusar na próxima aula práticaetapa).
 
 
 
 
[[Imagem:Plasmid_replication_(english).svg‎|thumb|right|500pxsvg]]
 
'''''Superbroth''''': (32 g triptona + 20 g extracto de levedura + 5 g NaCl + 1,25 mL 4N NaOH) / litro
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