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Engenharia genética/Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria: diferenças entre revisões

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}}
 
== Preparação das soluções para PCR ==
 
#* Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos ''eppendorf'' marcados (1 e 2), fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 mL de Taq e 900 mL do tampão de diluição 1X e depois 5X (200 μL → 800 μL);
# Fazer 3 diluições sucessivas de 2X em 3 tubos ''eppendorf'' marcados (3, 4 e 5) a partir de 500 μL da diluição de 1000X e 500 μL de tampão de diluição 1X;▼
# Colocar 20 μL das diluições em diferentes tubos de PCR: 10X; 50X; 100X; 200X; 400X (5 tubos);▼
# Adicionar 20 μL de PCR ''MasterMix'' a cada tubo de PCR;▼
# Colocar os tubos em gelo;▼
# Depois de agitadas no ''vortex'', as misturas são sujeitas a PCR de acordo com as condições especificadas na tabela abaixo;▼
# Durante o tempo de espera, desenhar no computador os ''primers'' necessários para amplificar o gene GFP;
# Misturar 5 μL de produto de PCR com 5 μL de tampão de aplicação;▼
# Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%;▼
# O instrutor irá fazer um gel com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência;▼
# Correr o gel, durante 20 minutos, a 220 volts;▼
# Fotografar o gel;▼
# Comparar o rendimento do PCR com o rendimento obtido com a Taq polimerase comercial;▼
# Calcular o número de unidades na preparação.▼
 
▲#* Fazer 3 diluições sucessivas de 2X em 3 tubos ''eppendorf'' marcados (3, 4 e 5) a partir de 500 μL da diluição de 1000X e 500 μL de tampão de diluição 1X;
 
▲#* Colocar 20 μL das diluições em diferentes tubos de PCR: 10X; 50X; 100X; 200X; 400X (5 tubos);
 
▲#* Adicionar 20 μL de PCR ''MasterMix'' a cada tubo de PCR;
 
▲#* Colocar os tubos em gelo;
 
▲#* Depois de agitadas no ''vortex'', as misturas são sujeitas a PCR de acordo com as condições especificadas na tabela abaixo;
tabela abaixo.
 
 
=== Condições do PCR ===▼
 
<center>
{| border '''Temperatura'''
| '''Temperatura'''|| '''Duração'''|| '''Fase'''
|-
| 94 ºC|| 120 seg || Desnaturação inicial
|-
| 94 ºC|| 20 seg || Desnaturação
|-
| 40 ºC|| 20 seg|| Emparelhamento
|-
| 72 ºC|| '''Taq''' = 20 seg e '''Pfu'''= 1 min 45 seg|| Elongamento
|-
| 72 ºC|| 120 seg|| Elongamento final
|}
 
Esta sequência é repetida 30 vezes. </center>
 
 
 
 
 
 
▲#* Misturar 5 &mu;L de produto de PCR com 5 &mu;L de tampão de aplicação;
 
▲#* Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%;
 
▲#* O instrutor irá fazer um gel com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência;
 
▲#* Correr o gel, durante 20 minutos, a 220 volts;
 
▲#* Fotografar o gel;
 
▲#* Comparar o rendimento do PCR com o rendimento obtido com a Taq polimerase comercial;
 
▲#* Calcular o número de unidades na preparação.
 
 
== Condições do PCR ==
<center>
▲=== Condições do PCR ===
{| border '''Temperatura'''
| '''Temperatura'''|| '''Duração'''|| '''Fase'''
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