Engenharia genética/Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria: diferenças entre revisões
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== Preparação das soluções para PCR ==
[[Imagem:PCR tubes.png|thumb|right|270px|Conjunto de oito tubos de PCR, cada um contendo 100μL.]]
* Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos ''eppendorf'' marcados (1 e 2), fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 mL de Taq e 900 mL do tampão de diluição 1X e depois 5X (200 μL → 800 μL);
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* Depois de agitadas no ''vortex'', as misturas são sujeitas a PCR de acordo com as condições especificadas na
tabela abaixo.
== Condições do PCR ==
[[Imagem:Pcr machine.jpg|thumb|right|220px|Aparelho de PCR (termociclador).]]
{| border '''Temperatura'''
| '''Temperatura'''|| '''Duração'''|| '''Fase'''
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|}
Esta sequência é repetida 30 vezes.
== Análise Electroforética dos produtos de PCR ==
* Misturar 5 μL de produto de PCR com 5 μL de tampão de aplicação;
* Aplicar as amostras num [http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel gel de agarose] 0,8%;
* O instrutor
* Correr o gel, durante 20 minutos, a 220 volts;
* Fotografar o gel
[[Imagem:Gel electrophoresis apparatus.JPG|thumb|left|350px|Aparelho de Electroforese em gel. O gel de agarose é colocado nesta caixa com solução tampão e a corrente eléctrica é-lhe aplicada. O terminal negativo está no topo (fio preto), então o DNA migra em direcção ao observador.]]
[[Imagem:Agarose-Gelelektrophorese.png|thumb|right|450px|Representação esquemática do processo de electroforese, detalhando as sucessivas etapas. (1) Gel de agarose com três poços. (2) Injecção da solução padrão de DNA marcadora de pesos moleculares, no primeiro poço. (3) Após o padrão estar injectado, injectam-se as amostras no segundo e terceiro poços. (4) Aplica-se uma corrente eléctrica que provoca a migração do DNA para o pólo positivo, devido à carga negativa conferida pelo esqueleto fosfatado. (5) As cadeias de DNA pequenas migram mais rapidamente, por outro lado, as maiores migram mais lentamente através do gel; normalmente, durante este processo, o DNA não é visível, por isso adiciona-se ao DNA um corante ou marcador para evitar que o DNA migre para fora do gel. (6) Adicionar o corante ou marcador também ao padrão de DNA.]]
[[Imagem:AgaroseGel.jpg|thumb|centre|300px|Gel de agarose preparado para análise de DNA. O primeiro poço contém um padrão de DNA para determinação de pesos moleculares; os quatro poços seguintes mostram fragmentos de DNA com variados tamanhos, que estão presentes em algumas mas não em todas as amostras.]]
== Actividades propostas ==
* Comparar o rendimento do PCR obtido com o
* Calcular o número de unidades na preparação.
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