Engenharia genética/Transformação e gap-repair em Saccharomyces cerevisiae: diferenças entre revisões

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# Plaquear 200 μL de células de cada tubo em placas marcadas ('''+''') e ('''-''');
# Incubar as placas a 30 ºC.
 
 
 
 
 
 
O gene GFP vai ser clonado no vector p426GPD. Este vector está descrito por Mumberg et al. (1995).
 
Mumberg D, Muller R, Funk M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 1995 Apr 14;156(1):119-22. PMID: 7737504
 
Este artigo está no PubMed. Google "pubmed".
 
 
Este vector tem um promotor forte de S. cerevisiae que é do gene GPD (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase). Este gene mudou o nome para TDH3. O terminador é do gene CYC1 (cytochrome C).
 
 
Nós vamos utilizar uma técnica que se chama “Gap-repair”.
 
 
Esta técnica é baseada na recombinação entre o fragmento (Gene GFP) e o vector (plasmídeo p426GPD) através de regiões homólogas curtas (Fig. 1).
 
 
EXEMPLO: Gap-repair com quatro bases de homologia
 
(em realidade precisamos de 30 pb)
 
Fragmento: 5-GATCatgttgtaaACGT-3
3-CTAGtacaacattTGCA-5
Vector: 5-acgagGATC ACGTagagacagt-3
3-tgctcCTAG TGCAtctctgtca-5
 
 
Isto significa que é necessário adicionar uma sequência de 30 pb em cada lado do produto de PCR que é homólogo às extremidades do vector. Podemos adicionar esta sequência na extremidade 5’ em cada primer.
 
 
O promotor do TDH3 acaba imediatamente antes do codão de iniciação do gene (ATG). O terminador começa imediatamente depois do codão stop do CYC1 (TAA).
 
 
E necesário saber as sequências do promotor TDH3 e do terminador CYC1:
 
 
A maneira mais fácil de obter sequências de Saccharomyces cerevisiae é através da base de dados “Saccharomyces genome database”.
 
 
Este link permite obter qualquer sequência de S. cerevisiae:
 
http://db.yeastgenome.org/cgi-bin/seqTools
 
 
Escreva “TDH3” ou “CYC1” na janela para obter a página contendo a sequência de cada gene e 30 pb antes ou depois dos genes:
Use o link “DNA of region” com o formato GCG.
 
 
Temos a sequência do gene TDH3 com trinta bases antes do gene (promotor) e o gene CYC1 com trinta bases depois (terminador).
 
 
O primer forward necessita de uma região de homologia com os últimos 30 pb do promotor TDH3 e o primer reverse com os primeiros 30 pb do terminador CYC1.
 
A sequência dos primers deve ser descrita no relatório final.
 
==Ligações Externas==
 
[http://jb.asm.org/cgi/reprint/155/2/747?view=long&pmid=6307979 In Vivo Ligation of Linear DNA Molecules to Circular Forms in the Yeast ''Saccharomyces cerevisiae'']
 
[http://home.cc.umanitoba.ca/~gietz/method.html HIGH EFFICIENCY TRANSFORMATION]
 
[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2828185?ordinalpos=35&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum Plasmid construction by homologous recombination in yeast.]
 
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