Engenharia genética/Transformação e gap-repair em Saccharomyces cerevisiae: diferenças entre revisões
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== Protocolo Experimental ==
Em condições de assepsia:
* Centrifugar, durante 30 segundos, na velocidade máxima, 2 mL de cultura de levedura colocando 1 mL em cada tubo ''eppendorf'';
* Remover o sobrenadante;
* Ressuspender as células em 1 mL de água desionizada;
* Centrifugar os tubos durante 30 segundos, na velocidade máxima;
* Remover o sobrenadante;
* Adicionar 326 μL de mistura de transformação* a cada tubo, e manter em gelo;
* Adicionar 10 μL de vector a cada tubo;
* Adicionar 24 μL de produto de PCR a um dos tubos ''eppendorf''. Marcar esse tubo com o sinal ('''+''');
* Adicionar 24 μL de água desionizada ao outro tubo ''eppendorf''. Marcar esse tubo com o sinal ('''-''');
* Vortexar ambos os tubos durante 60 segundos, no máximo da velocidade;
* Num banho térmico efectuar um choque térmico a 42 ºC, durante 40 minutos;
* Centrifugar os tubos, durante 30 segundos, na velocidade máxima;
* Remover o sobrenadante;
* Adicionar 1 a 2 mL de água desionizada a cada tubo ''eppendorf'';
* Ressuspender as células;
* Plaquear 200 μL de células de cada tubo em placas marcadas ('''+''') e ('''-''');
* Incubar as placas a 30 ºC.
(*) Mistura de transformação:
240 μL PEG (50%, v/v) + 36 μL 1,0 M acetato de Lítio + 50 μL SS-DNA (2,0 mg/mL)
== Noções Básicas ==
O gene GFP vai ser clonado no vector p426GPD. Este vector está descrito por Mumberg et al. (1995) em
[http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T39-3Y5FR8V-77&_user=2459786&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000057396&_version=1&_urlVersion=0&_userid=2459786&md5=c522b0fe58e1ad6ee4ea76b57be18018 Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds].
Este vector tem um '''promotor''' forte de S. cerevisiae que é do gene GPD (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).
Este gene mudou o nome para '''TDH3'''.
O '''terminador''' é do gene '''CYC1''' (cytochrome C).
== Noções Práticas ==
Nós vamos utilizar uma técnica chamada ''Gap-repair'' ([http://www.biology.duke.edu/model-system/ymsg/cloning.html Modelo de Recombinação Homóloga]).
O ''Gap-repair'' é baseado na recombinação entre o fragmento (Gene GFP) e o vector (plasmídeo p426GPD) através de regiões homólogas curtas.
EXEMPLO: [http://drnelson.utmem.edu/gaprepair.gif '''''Gap-repair'''''] com quatro bases de homologia (na realidade precisamos de 30 pb):
Fragmento: 5' - GATCatgttgtaaACGT - 3'
3' - CTAGtacaacattTGCA - 5'
Vector: 5' - acgagGATC ACGTagagacagt - 3'
3' - tgctcCTAG TGCAtctctgtca - 5'
* Isto significa que é necessário adicionar uma sequência de 30 pb em cada lado do produto de PCR que é homólogo às extremidades do vector. Podemos adicionar esta sequência na extremidade 5’ em cada primer.
* O promotor do TDH3 acaba imediatamente antes do codão de iniciação do gene (ATG). O terminador começa imediatamente depois do codão stop do CYC1 (TAA).
* É necessário saber as sequências do promotor TDH3 e do terminador CYC1:
*A maneira mais fácil de obter sequências de Saccharomyces cerevisiae é através da [http://www.yeastgenome.org Saccharomyces Genome Database].
* Aqui pode obter [http://db.yeastgenome.org/cgi-bin/seqTools Gene/Sequence Resources qualquer sequência de ''S. cerevisiae''].
* Escreva '''“TDH3”''' ou '''“CYC1”''' na janela para obter a sequência de cada gene e 30 pb antes ou depois dos genes (Use o link “DNA of region” com o formato GCG).
* Temos a sequência do gene TDH3 com trinta bases antes do gene (promotor) e o gene CYC1 com trinta bases depois (terminador).
* O ''primer forward'' necessita de uma região de homologia com os últimos 30 pb do promotor TDH3 e o ''primer reverse'' com os primeiros 30 pb do terminador CYC1.
==Ligações Externas==
Linha 103:
[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2828185?ordinalpos=35&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum Plasmid construction by homologous recombination in yeast.]
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