Engenharia genética/Transformação e gap-repair em Saccharomyces cerevisiae: diferenças entre revisões

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}}
 
== Protocolo Experimental ==
http://drnelson.utmem.edu/gaprepair.gif
 
Em condições de assepsia:
# Centrifugar, durante 30 segundos, na velocidade máxima, 2 mL de cultura de levedura colocando 1 mL em cada tubo ''eppendorf'';
# Remover o sobrenadante;
# Ressuspender as células em 1 mL de água desionizada;
# Centrifugar os tubos durante 30 segundos, na velocidade máxima;
# Remover o sobrenadante;
# Adicionar 326 μL de mistura de transformação* a cada tubo, e manter em gelo;
# Adicionar 10 μL de vector a cada tubo;
# Adicionar 24 μL de produto de PCR a um dos tubos ''eppendorf''. Marcar esse tubo com o sinal ('''+''');
# Adicionar 24 μL de água desionizada ao outro tubo ''eppendorf''. Marcar esse tubo com o sinal ('''-''');
# Vortexar ambos os tubos durante 60 segundos, no máximo da velocidade;
# Num banho térmico efectuar um choque térmico a 42 ºC, durante 40 minutos;
# Centrifugar os tubos, durante 30 segundos, na velocidade máxima;
# Remover o sobrenadante;
# Adicionar 1 a 2 mL de água desionizada a cada tubo eppendorf;
# Ressuspender as células;
# Plaquear 200 μL de células de cada tubo em placas marcadas ('''+''') e ('''-''');
# Incubar as placas a 30 ºC.
 
* Centrifugar, durante 30 segundos, na velocidade máxima, 2 mL de cultura de levedura colocando 1 mL em cada tubo ''eppendorf'';
 
* Remover o sobrenadante;
(*) Mistura de transformação:
240 μL PEG (50%, v/v) + 36 μL 1,0 M acetato de Lítio + 50 μL SS-DNA (2,0 mg/mL)
 
* Ressuspender as células em 1 mL de água desionizada;
 
* Centrifugar os tubos durante 30 segundos, na velocidade máxima;
 
* Remover o sobrenadante;
O gene GFP vai ser clonado no vector p426GPD. Este vector está descrito por Mumberg et al. (1995).
 
* Adicionar 326 μL de mistura de transformação* a cada tubo, e manter em gelo;
Mumberg D, Muller R, Funk M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 1995 Apr 14;156(1):119-22. PMID: 7737504
 
* Adicionar 10 μL de vector a cada tubo;
Este artigo está no PubMed. Google "pubmed".
 
* Adicionar 24 μL de produto de PCR a um dos tubos ''eppendorf''. Marcar esse tubo com o sinal ('''+''');
 
* Adicionar 24 μL de água desionizada ao outro tubo ''eppendorf''. Marcar esse tubo com o sinal ('''-''');
Este vector tem um promotor forte de S. cerevisiae que é do gene GPD (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase). Este gene mudou o nome para TDH3. O terminador é do gene CYC1 (cytochrome C).
 
* Vortexar ambos os tubos durante 60 segundos, no máximo da velocidade;
 
* Num banho térmico efectuar um choque térmico a 42 ºC, durante 40 minutos;
Nós vamos utilizar uma técnica que se chama “Gap-repair”.
 
* Centrifugar os tubos, durante 30 segundos, na velocidade máxima;
 
* Remover o sobrenadante;
Esta técnica é baseada na recombinação entre o fragmento (Gene GFP) e o vector (plasmídeo p426GPD) através de regiões homólogas curtas (Fig. 1).
 
* Adicionar 1 a 2 mL de água desionizada a cada tubo ''eppendorf'';
 
* Ressuspender as células;
EXEMPLO: Gap-repair com quatro bases de homologia
 
* Plaquear 200 μL de células de cada tubo em placas marcadas ('''+''') e ('''-''');
(em realidade precisamos de 30 pb)
 
* Incubar as placas a 30 ºC.
Fragmento: 5-GATCatgttgtaaACGT-3
3-CTAGtacaacattTGCA-5
Vector: 5-acgagGATC ACGTagagacagt-3
3-tgctcCTAG TGCAtctctgtca-5
 
 
(*) Mistura de transformação:
Isto significa que é necessário adicionar uma sequência de 30 pb em cada lado do produto de PCR que é homólogo às extremidades do vector. Podemos adicionar esta sequência na extremidade 5’ em cada primer.
240 μL PEG (50%, v/v) + 36 μL 1,0 M acetato de Lítio + 50 μL SS-DNA (2,0 mg/mL)
 
 
O promotor do TDH3 acaba imediatamente antes do codão de iniciação do gene (ATG). O terminador começa imediatamente depois do codão stop do CYC1 (TAA).
 
== Noções Básicas ==
 
O gene GFP vai ser clonado no vector p426GPD. Este vector está descrito por Mumberg et al. (1995) em
E necesário saber as sequências do promotor TDH3 e do terminador CYC1:
[http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T39-3Y5FR8V-77&_user=2459786&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000057396&_version=1&_urlVersion=0&_userid=2459786&md5=c522b0fe58e1ad6ee4ea76b57be18018 Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds].
 
Este vector tem um '''promotor''' forte de S. cerevisiae que é do gene GPD (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).
 
Este gene mudou o nome para '''TDH3'''.
A maneira mais fácil de obter sequências de Saccharomyces cerevisiae é através da base de dados “Saccharomyces genome database”.
 
O '''terminador''' é do gene '''CYC1''' (cytochrome C).
 
Este link permite obter qualquer sequência de S. cerevisiae:
 
[http://db.yeastgenome.org/cgi-bin/seqTools Gene/Sequence Resources]
 
== Noções Práticas ==
 
Nós vamos utilizar uma técnica chamada ''Gap-repair'' ([http://www.biology.duke.edu/model-system/ymsg/cloning.html Modelo de Recombinação Homóloga]).
Escreva “TDH3” ou “CYC1” na janela para obter a página contendo a sequência de cada gene e 30 pb antes ou depois dos genes:
Use o link “DNA of region” com o formato GCG.
 
O ''Gap-repair'' é baseado na recombinação entre o fragmento (Gene GFP) e o vector (plasmídeo p426GPD) através de regiões homólogas curtas.
 
Temos a sequência do gene TDH3 com trinta bases antes do gene (promotor) e o gene CYC1 com trinta bases depois (terminador).
 
EXEMPLO: [http://drnelson.utmem.edu/gaprepair.gif '''''Gap-repair'''''] com quatro bases de homologia (na realidade precisamos de 30 pb):
Fragmento: 5' - GATCatgttgtaaACGT - 3'
3' - CTAGtacaacattTGCA - 5'
Vector: 5' - acgagGATC ACGTagagacagt - 3'
3' - tgctcCTAG TGCAtctctgtca - 5'
 
 
* Isto significa que é necessário adicionar uma sequência de 30 pb em cada lado do produto de PCR que é homólogo às extremidades do vector. Podemos adicionar esta sequência na extremidade 5’ em cada primer.
 
* O promotor do TDH3 acaba imediatamente antes do codão de iniciação do gene (ATG). O terminador começa imediatamente depois do codão stop do CYC1 (TAA).
 
* É necessário saber as sequências do promotor TDH3 e do terminador CYC1:
 
*A maneira mais fácil de obter sequências de Saccharomyces cerevisiae é através da [http://www.yeastgenome.org Saccharomyces Genome Database].
 
* Aqui pode obter [http://db.yeastgenome.org/cgi-bin/seqTools Gene/Sequence Resources qualquer sequência de ''S. cerevisiae''].
 
* Escreva '''“TDH3”''' ou '''“CYC1”''' na janela para obter a sequência de cada gene e 30 pb antes ou depois dos genes (Use o link “DNA of region” com o formato GCG).
 
* Temos a sequência do gene TDH3 com trinta bases antes do gene (promotor) e o gene CYC1 com trinta bases depois (terminador).
 
* O ''primer forward'' necessita de uma região de homologia com os últimos 30 pb do promotor TDH3 e o ''primer reverse'' com os primeiros 30 pb do terminador CYC1.
 
O primer forward necessita de uma região de homologia com os últimos 30 pb do promotor TDH3 e o primer reverse com os primeiros 30 pb do terminador CYC1.
 
A sequência dos primers deve ser descrita no relatório final.
 
==Ligações Externas==
[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2828185?ordinalpos=35&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum Plasmid construction by homologous recombination in yeast.]
 
 
[http://www.biology.duke.edu/model-system/ymsg/cloning.html Cloning by Homologous Recombination]
 
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