Engenharia genética/Microscopia de fluorescência e SDS-PAGE: diferenças entre revisões

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== Preparação para SDS-PAGE ==
 
* Agitar a amostra durante 10-20 segundos;
* Preparar dois ''eppendorfs'' com 20 μL de Tampão de amostra SDS;
 
* Adicionar 20 μL de amostra aos dois ''eppendorfs'' com 20 μL de Tampão de amostra SDS (não transferir restos celulares!);
# Spin your sample for 10-20s
 
# Prepare two eppendorf tubes with 20 uL SDS-sample buffer
* Aquecer os ''eppendorfs'' durante 5 minutos;
# Add 20 uL of the samples to the tubes with the SDS-sample buffer, do not transfer cell debris!
 
# Boil the tubes for 5 min.
#* LoadCarregar 10 uLμL ofda themistura mixture on theno SDS-PAGE.;
 
# Run the gel for 30 min – 1 hour at 200v
* Deixar o gel correr entre 30 minutos a 1 hora, a 200 V;
While the gel is running do the following:
 
# Prepare 3 eppendorf tubes with 1 mL water in each.
 
# Pick three colonies from the plate marked (+) and resuspend each colony in one of the tubes.
 
# Put 10 uL from each tube on a microscopic slide.
== Preparação para Microscopia de Fluorescência ==
# Put a coverslip on top of the liquid.
 
# Observe the cells using fluorescent microscopy
* Preparar três ''eppendorfs'' com 1 mL de água em cada;
# Design the primers that was used for the amplification of GFP with the addition of the sequences needed for gap-repair.
 
* Picar três colónias da placa marcada (+) e ressuspender cada colónia num dos ''eppendorfs'';
 
* Colocar 10 μL de cada tubo numa lâmina para microscópio;
 
* Colocar uma lamela sobre o líquido;
 
* Observar as células no [http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescent_microscopy Microscópio de Fluorescência];
 
* Desenhar os ''primers'' que foram usados para a amplificação do gene GFP com a adição das sequências necessárias para o ''gap-repair''.
 
 
 
== Conceitos Básicos ==
 
[http://en.wikipedia.org/wiki/SDS_PAGE SDS-PAGE] é uma técnica usada em bioquímica, genética e biologia molecular para separar proteínas de acordo com a sua mobilidade electroforética.
 
 
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