Engenharia genética/Clonagem por PCR

PCR é uma técnica muito usada para clonar enzimaticamente fragmentos de DNA, sem usar microrganismos vivos.

Variação da temperatura e das cadeias de DNA ao longo dos quatro primeiros ciclos de PCR.

Esta técnica permite um aumento exponencial da quantidade de DNA em amplificação.

O processo desenvolvido no PCR é cíclico e ocorre segundo três etapas sucessivas que, normalmente, se repetem por 30 ou 40 ciclos.

• A iniciação do processo consiste em aquecer à temperatura de 94-96 ºC (ou 98 ºC para polimerases extremamente termoestáveis), durante alguns minutos.

Esta etapa é essencial para as DNA polimerases que necessitam de ativação por calor.

• O primeiro passo do ciclo consiste na desnaturação à temperatura de 94-98 ºC, por 20-30 segundos.

Nesta etapa, ocorre dissociação das duplas cadeias de DNA template (molde) e primers, através da destruição das pontes de Hidrogênio estabelecidas entre bases complementares. Obtêm-se somente cadeias simples de DNA.

Esquema representativo do processo de Polymerase chain reaction (PCR)

• De seguida ocorre o emparelhamento a 50-65 ºC, por 20-40 segundos.

Os primers estão sujeitos ao movimento Browniano.

As ligações mais estáveis — pontes de Hidrogênio DNA-DNA — formam-se entre os primers e o template que emparelham exatamente e, nessa pequena porção de DNA de dupla cadeia, a polimerase liga-se e copia um pouco do template.

Quando existe uma porção emparelhada e ligeiramente polimerisada, a ligação é tão forte, que dificilmente é quebrada.

• Finalmente ocorre a polimerização / elongação a 72ºC (temperatura usada com Taq polimerase).

A polimerase adiciona dNTPs de 5'-3', sintetizando uma nova cadeia de DNA complementar à cadeia de DNA molde.

O tempo desta etapa depende da DNA polimerase usada e do comprimento do fragmento de DNA a amplificar.

Replicação ou síntese de DNA é o processo em que se copia a molécula de DNA em dupla cadeia.

Como ambas as cadeias de DNA são copiadas durante o PCR, há um aumento exponencial do número de cópias do gene.

Supondo que existe apenas uma cópia do gene desejado antes do ciclo começar, após 1 ciclo, haverá 2 cópias, depois de 2 ciclos, haverá 4 cópias, três ciclos resultarão em 8 cópias e assim progressivamente.

Para análise posterior dos produtos de PCR, pode proceder-se a uma electroforese.