Engenharia genética/Microscopia de fluorescência e SDS-PAGE

Preparação para SDS-PAGE

• Agitar a amostra durante 10-20 segundos;

• Preparar dois eppendorfs com 20 μL de Tampão de amostra SDS;

• Adicionar 20 μL de amostra aos dois eppendorfs com 20 μL de Tampão de amostra SDS (não transferir restos celulares!);

• Aquecer os eppendorfs durante 5 minutos;

• Carregar 10 μL da mistura no SDS-PAGE;

• Deixar o gel correr entre 30 minutos a 1 hora, a 200 V;

Preparação para Microscopia de Fluorescência

• Preparar três eppendorfs com 1 mL de água em cada;

• Picar três colónias da placa marcada (+) e ressuspender cada colónia num dos eppendorfs;

• Colocar 10 μL de cada tubo numa lâmina para microscópio;

• Colocar uma lamela sobre o líquido;

• Observar as células no Microscópio de Fluorescência;

• Desenhar os primers que foram usados para a amplificação do gene GFP com a adição das sequências necessárias para o gap-repair.

Conceitos Básicos

SDS-PAGE é uma técnica usada em bioquímica, genética e biologia molecular para separar proteínas de acordo com a sua mobilidade electroforética.

Ligações Externas

Electrophoresis - Molecular Weight Determination by SDS-PAGE

Mini-PROTEAN® II Electrophoresis Cell Instruction Manual

Laemmli Sample Buffer

Protein Standards