Engenharia genética/Preparação das Taq e Pfu DNA polimerases de Escherichia coli recombinante
- Inocular 4 mL de meio LB amp com Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;
- Incubar a 37 °C, com agitação.
- Inocular 200 mL de SuperBroth com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37°C, com agitação;
- Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37°C, com agitação.
- Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;
- Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 °C);
- Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de tampão A;
- Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4°C);
- Ressuspender as células em 2 mL de tampão A + 20 mg lisozima (concentração final = 4 mg/mL);
- Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;
- Adicionar 2 mL de tampão B com PMSF (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão);
- No gelo, guardar ≈0.1 mL da solução num tubo eppendorf, previamente marcado como Amostra 1;
- Incubar a 75 °C, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;
- Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 °C);
- Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos eppendorf;
- Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4°C);
- Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL;
- No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo eppendorf, previamente marcado como Amostra 2;
- Misturar com igual volume (≈4 mL) tampão Storage com 50 % de glicerol;
- Misturar com igual volume (≈8 mL) tampão Storage com 75 % de glicerol;
- O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ≈8 mL de solução;
- Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 °C (para usar na próxima etapa).
- Superbroth: (32 g triptona + 20 g extracto de levedura + 5 g NaCl + 1,25 mL 4N NaOH) / litro.
- Tampão A: 50 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM dextrose + 1 mM EDTA.
- Tampão B: 10 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM KCl + 1 mM EDTA + 0.5% Tween 20 (1%) + 1 mM PMSF.
- Tampão Storage: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 100 mM NaCl + 0.1 mM EDTA + 0.5 mM DTT + 1% Triton X-100 + 50% / 75% glicerol.