Engenharia genética/Rendimento do PCR
Neste trabalho prático, infelizmente, não nos foi possível amplificar a Pfu DNA polimerase.
Rendimento do PCR usando Taq polimerase comercial vs preparada
editarDa solução de Taq Comercial (c = 1 U/μL) pipetámos 5 μL (5 U) e diluímos em 100 μL (factor diluição = 20x).
A partir desta solução de Taq pipetámos os volumes indicados nas preparações A a E (tabela 2), aos quais adicionámos diferentes volumes de tampão, perfazendo o volume de 20 μL para todas as preparações. Deste modo, obteve-se um gradiente de concentrações de Taq decrescente de A para E.
A quantidade de Taq (U) presente em cada preparação, corresponde aos valores indicados, calculados de acordo com a seguinte relação: (exemplificando para a preparação B) 5 U ----- 100 μL Q ----- 17 μL Então: Q = 0,85 U
De seguida, adicionou-se igual volume de Mastermix a todas as preparações; como o volume das mesmas duplicou para 40 μL, a concentração de Taq presente em cada preparação corresponde à razão entre a Quantidade (U) e o Volume (40 μL).
O volume de Mastermix adicionado é um parâmetro constante para as diferentes preparações, de modo a que se possam apurar conclusões relativamente à variável em estudo, ou seja, a concentração de Taq DNA polimerase e sua capacidade em realizar efectivamente a Polimerase Chain Reaction obtendo-se, consequentemente, produtos de PCR detectáveis no gel da electroforese.
Como representado na tabela abaixo, detectou-se a presença de produtos de PCR nas preparações A e B.
Preparação e características das soluções (A a E) de diferentes concentrações de Taq DNA polimerase comercial para aplicação no gel electroforético.
editar| A | B | C | D | E | |
| Volume solução Taq (μL) | 20 | 17 | 13 | 7 | 3 |
| Volume Tampão (μL) | 0 | 3 | 7 | 13 | 17 |
| Quantidade Taq (U) | 1 | 0,85 | 0,65 | 0,35 | 0,15 |
| Volume Mastermix (μL) | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Concentração Taq (U/μL) | 2,50x10-2 | 2,13x10-2 | 1,63x10-2 | 8,75x10-3 | 3,75x10-3 |
| Electroforese | + | + | - | - | - |
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