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Engenharia genética/Preparação das Taq e Pfu DNA polimerases de Escherichia coli recombinante: diferenças entre revisões

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[[Engenharia Genética:Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria|Amplificação por PCR do gene GFP de ''Aequorea victoria'']]
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[[Imagem:E coli at 10000x.jpg|thumb|right|400px|Micrografia electrónica a baixa temperatura de um agregado de bactérias ''Escherichia coli'' (amplificação: 10000X).]]
 
[[Imagem:EscherichiaColi_NIAIDEscherichiaColi NIAID.jpg|thumb|right|400px|Micrografia electrónica de bactérias ''Escherichia coli''.]]
 
[[Imagem:Plasmid_replication_Plasmid replication (english).svg|thumb|right|400px|Comparação da actividade de plasmídeos não-integrativos (acima da linha) com epissomas (abaixo da linha), durante a divisão celular. Na primeira situação, está representada uma bactéria com o seu DNA cromossómico e plasmídeos dividindo-de em duas bactérias idênticas, cada uma com o seu DNA cromossómico e plasmídeos. Na primeira situação, está representada uma bactéria com o seu DNA cromossómico, mas com um epissoma. A seguir, observa-se a mesma bactéria após integração do epissoma no DNA cromossómico. Esta bactéria divide-se em duas bactérias idênticas, cada uma com o epissoma integrado no seu genoma.]]
 
== Dia 1 ==
 
* Inocular 4 mL de [http://en.wikipedia.org/wiki/LB_medium meio LB] amp com ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;
* [http://en.wikipedia.org/wiki/Incubator_%28microbiology%29 Incubar] a 37 º°C, com agitação.▼
 
▲* [http://en.wikipedia.org/wiki/Incubator_%28microbiology%29 Incubar] a 37 ºC, com agitação.
 
 
 
== Dia 2 ==
 
* Inocular 200 mL de ''SuperBroth'' com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37º°C, com agitação;
 
* Quando a [http://en.wikipedia.org/wiki/Optical_density Densidade Óptica] (λ=600nm) ≈0.4, adicionar 0.4 mL [http://en.wikipedia.org/wiki/IPTG IPTG] 1M (concentração final = 2 mM); ▼
 
* Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37ºC, com agitação.▼
 
▲* Quando a [http://en.wikipedia.org/wiki/Optical_density Densidade Óptica] (λ=600&lambdanbsp;=600nmnm) ≈0≈0.4, adicionar 0.4 mL [http://en.wikipedia.org/wiki/IPTG IPTG] 1M (concentração final = 2 mM);
 
▲* Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37º°C, com agitação.
 
== Dia 3 ==
 
* Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;
* [http://en.wikipedia.org/wiki/Laboratory_centrifuge Centrifugar] (5000 rpm, 10 minutos, 4 º°C);▼
 
▲* [http://en.wikipedia.org/wiki/Laboratory_centrifuge Centrifugar] (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
 
* Eliminar o sobrenadante e ressuspender o [http://en.wikipedia.org/wiki/Pellet ''pellet''] em 5 mL de tampão A;
 
* Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4º°C);
 
* Ressuspender as células em 2 mL de tampão A + 20  mg [http://pt.wikipedia.org/wiki/Lisozima lisozima] (concentração final = 4  mg/mL);
 
* Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;
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* Adicionar 2 mL de tampão B com [http://en.wikipedia.org/wiki/PMSF PMSF] (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão);
 
* No gelo, guardar ≈0≈0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 1''';
 
* Incubar a 75 º°C, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;
 
* Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 º°C);
 
* Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos ''eppendorf'';
 
* Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4º°C);
 
* Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL;
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* No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 2''';
 
* Misturar com igual volume (≈4≈4 mL) tampão ''Storage'' com 50 % de glicerol;
 
* Misturar com igual volume (≈8≈8 mL) tampão ''Storage'' com 75 % de glicerol;
 
* O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ≈8 mL de solução;▼
 
* Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 ºC (para usar na próxima etapa).▼
 
▲* O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ≈8≈8 mL de solução;
 
▲* Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 º°C (para usar na próxima etapa).
 
== Soluções ==
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* '''Tampão ''Storage''''': 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 100 mM NaCl + 0.1 mM EDTA + 0.5 mM DTT + 1% Triton X-100 + 50% / 75% glicerol.
 
 
 
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