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Engenharia genética/Preparação das Taq e Pfu DNA polimerases de Escherichia coli recombinante: diferenças entre revisões

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Linha 3:
[[Engenharia Genética:Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria|Amplificação por PCR do gene GFP de ''Aequorea victoria'']]
}}
[[Imagem:E coli at 10000x.jpg|thumb|leftright|500px400px|Micrografia electrónica a baixa temperatura de um agregado de bactérias ''E.Escherichia coli'' (amplificação: 10000X).]]▼
 
[[Imagem:E coli.jpg|thumb|right|400px|Micrografia electrónica de bactérias ''Escherichia coli''.]]
 
▲[[Imagem:E coli at 10000x.jpg|thumb|left|500px|Micrografia electrónica a baixa temperatura de um agregado de bactérias ''E. coli'' (amplificação: 10000X).]]
 
[[Imagem:Plasmid_replication_(english).svg|thumb|right|400px|Comparação da actividade de plasmídeos não-integrativos (acima da linha) com epissomas (abaixo da linha), durante a divisão celular. Na primeira situação, está representada uma bactéria com o seu DNA cromossómico e plasmídeos dividindo-de em duas bactérias idênticas, cada uma com o seu DNA cromossómico e plasmídeos. Na primeira situação, está representada uma bactéria com o seu DNA cromossómico, mas com um epissoma. A seguir, observa-se a mesma bactéria após integração do epissoma no DNA cromossómico. Esta bactéria divide-se em duas bactérias idênticas, cada uma com o epissoma integrado no seu genoma.]]
 
=== Dia 1 ===▼
[[Imagem:E coli.jpg|thumb|right|500px]]]
 
#* Inocular 4 mL de [http://en.wikipedia.org/wiki/LB_medium meio LB] amp com ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;▼
 
#* [http://en.wikipedia.org/wiki/Incubator_%28microbiology%29 Incubar] a 37 ºC, com agitação.▼
▲=== Dia 1 ===
 
▲# Inocular 4 mL de [http://en.wikipedia.org/wiki/LB_medium meio LB] amp com ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;
 
▲# [http://en.wikipedia.org/wiki/Incubator_%28microbiology%29 Incubar] a 37 ºC, com agitação.
 
=== Dia 2 ===▼
 
* Inocular 200 mL de ''SuperBroth'' com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37ºC, com agitação;
 
#* Quando a [http://en.wikipedia.org/wiki/Optical_density Densidade Óptica] (λ=600nm) ≈0.4, adicionar 0.4 mL [http://en.wikipedia.org/wiki/IPTG IPTG] 1M (concentração final = 2 mM); ▼
▲=== Dia 2 ===
 
#* InocularDeixar 200crescer mLdurante de16 ''SuperBroth''a com20 0.4horas, mLcom da cultura anterior e incubarincubação a 37ºC, com agitação;.
 
▲# Quando a [http://en.wikipedia.org/wiki/Optical_density Densidade Óptica] (λ=600nm) ≈0.4, adicionar 0.4 mL [http://en.wikipedia.org/wiki/IPTG IPTG] 1M (concentração final = 2 mM);
 
# Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37ºC, com agitação.
 
=== Dia 3 ===▼
 
#* Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;▼
 
#* [http://en.wikipedia.org/wiki/Laboratory_centrifuge Centrifugar] (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);▼
▲=== Dia 3 ===
 
* Eliminar o sobrenadante e ressuspender o [http://en.wikipedia.org/wiki/Pellet ''pellet''] em 5 mL de tampão A;
▲# Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;
 
# [http://en.wikipedia.org/wiki/Laboratory_centrifuge* Centrifugar] (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
 
#* EliminarRessuspender oas sobrenadantecélulas eem 2 mL de tampão A + ressuspender20 omg [http://enpt.wikipedia.org/wiki/PelletLisozima ''pellet''lisozima] em(concentração 5final mL= de4 tampão Amg/mL);
 
#* Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;▼
▲# Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4ºC);
 
#* Ressuspender as células emAdicionar 2 mL de tampão AB + 20 mgcom [http://pten.wikipedia.org/wiki/LisozimaPMSF lisozimaPMSF] (concentraçãoadicionar finalPMSF =imediatamente 4antes mg/mLda utilização do tampão);
 
#* No gelo, guardar ≈0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 1''';▼
▲# Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;
 
#* Incubar a 75 ºC, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;▼
# Adicionar 2 mL de tampão B com [http://en.wikipedia.org/wiki/PMSF PMSF] (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão);
 
#* Centrifugar (153005000 rpm, 2010 minutos, 4 ºC);▼
▲# No gelo, guardar ≈0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 1''';
 
* Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos ''eppendorf'';
▲# Incubar a 75 ºC, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;
 
#* Centrifugar (500015300 rpm, 1020 minutos, 4 ºC);
 
#* Transferir o máximosobrenadante para possívelum detubo sobrenadanteFalcon para algunsde tubos15 ''eppendorf''mL;
 
#* No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 2''';▼
▲# Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4ºC);
 
#* Misturar com igual volume (≈4 mL) tampão ''Storage'' com 50 % de glicerol;▼
# Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL;
 
#* Misturar com igual volume (≈8 mL) tampão ''Storage'' com 75 % de glicerol;▼
▲# No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 2''';
 
#* O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ≈8 mL de solução;▼
▲# Misturar com igual volume (≈4 mL) tampão ''Storage'' com 50 % de glicerol;
 
#* Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 ºC (para usar na próxima etapa).▼
▲# Misturar com igual volume (≈8 mL) tampão ''Storage'' com 75 % de glicerol;
 
▲# O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ≈8 mL de solução;
 
▲# Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 ºC (para usar na próxima etapa).
 
== Soluções ==
 
* '''''Superbroth''''': (32 g triptona + 20 g extracto de levedura + 5 g NaCl + 1,25 mL 4N NaOH) / litro.
 
* '''Tampão A''': 50 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM dextrose + 1 mM EDTA.▼
 
* '''Tampão B''': 10 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM KCl + 1 mM EDTA + 0.5% Tween 20 (1%) + 1 mM PMSF .▼
[[Imagem:Plasmid_replication_(english).svg]]
 
* '''Tampão ''SuperbrothStorage''''': (3250 gmM triptonaTris-HCl (pH 8.0) + 20100 gmM extractoNaCl + 0.1 demM leveduraEDTA + 0.5 gmM NaClDTT + 1,25% mLTriton 4NX-100 NaOH)+ 50% / litro75% glicerol.
 
▲ '''Tampão A''': 50 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM dextrose + 1 mM EDTA
 
▲ '''Tampão B''': 10 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM KCl + 1 mM EDTA + 0.5% Tween 20 (1%) + 1 mM PMSF
 
'''Tampão Storage''': 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 100 mM NaCl + 0.1 mM EDTA + 0.5 mM DTT + 1% Triton X-100 + 50% / 75% glicerol
 
 
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