Histologia Humana/microscópio

Através do microscópio óptico (MO), também chamado de microscópio de luz, preparações coradas podem ser examinadas porque um feixe de luz é transmitido através do corte histológico. Um microscópio óptico pode ser simples ou composto: o microscópio simples possui uma única lente e só fornece uma imagem moderadamente aumentada do objeto que se está estudando; o microscópio composto consiste em uma série de lentes e fornece um aumento muito maior. Na disciplina de histologia, geralmente se utiliza microscópios ópticos compostos, podendo ser monocular ou binocular. O MO é tradicionalmente composto por partes mecânicas e ópticas.

Partes do Microscópio

Partes do microscópio óptico.

Partes mecânicas	Base ou Pé: estabiliza o MO sobre a bancada. Braço ou Coluna: se estende da base para cima (suporte). Mesa ou Platina: local onde se coloca a lâmina para observação. Parafuso macrométrico: botão para macrofocalização. Parafuso micrométrico: botão para microfocalização. Carriot: movimenta a lâmina sobre a platina. Revolver: onde se encontram as lentes objetivas. Canhão ou Tubo: suporte para oculares. Lâmpada: fonte de luz.
Partes ópticas	Oculares: conjunto de lentes de aumento. Ampliam a imagem formada pela objetiva. O aumento final da imagem é dado pela multiplicação do aumento da ocular pelo amento da objetiva; Objetivas: captam a luz oriunda do condensador e formam uma imagem ampliada do objeto, sendo fundamentais para a distinção de detalhes durante a observação. São em número de quatro: panorâmica, pequeno aumento, médio aumento e maior aumento ou imersão. Os aumentos são indicados por anéis coloridos: Vermelho: 4x Laranja: 10x Amarelo-verde: 40x Azul claro 100x Condensador: combinação de lentes que projeta a luz sobre o objeto; Diafragma ou Íris: controla a passagem de raios luminosos; Espelho: reflete os raios emanados da fonte de luz

Um microscópio óptico composto é um sistema de aumento em dois estágios: primeiro o objeto é aumentado pelas lentes da objetiva e depois novamente pelo segundo conjunto de lentes da ocular. O aumento total, como foi visto, é o produto dos aumentos de objetiva pelo da ocular. O valor gravado numa objetiva (4x, 10x, 40x, 100x) indica o aumento da objetiva; sendo assim, uma objetiva de 40x usada em combinação com uma ocular de 10x dá um aumento total de 400x. É interessante observar que a imagem projetada na retina está invertida da direta para a esquerda e de cima para baixo.

A qualidade de uma imagem depende não somente da capacidade da lente de aumentar, mas também de sua resolução (capacidade de lente de mostrar que dois objetos distintos estão separados por uma distância). A qualidade da lente depende de quão próximo sua resolução se aproxima do poder de resolução máximo do MO, isto é, 0,2μm (restrição esta determinada pelo comprimento de onda de luz visível); esta resolução permite a obtenção de boas imagens aumentadas de 1000 a 1500 vezes.

Resolução

O que se deseja em um microscópio é uma imagem aumentada e com muitos detalhes. O fator mais crítico para a obtenção de uma imagem aumentada e com muitos detalhes é o parâmetro chamado poder de resolução. Este pode ser definido como a menor distância entre duas partículas ou entre duas linhas, distância essa que possibilita que elas sejam vistas como dois objetos separados. O poder de resolução máximo do microscópio de luz (também chamado de resolução ou limite de resolução) é de aproximadamente 0,2 μm; esta resolução toma possível a obtenção de boas imagens aumentadas até 1.000 a 1.500 vezes. Objetos menores ou mais delgados que 0,2 μm (como, por exemplo, a membrana da célula ou um filamento de actina) não podem ser distinguidos com esse instrumento. Da mesma maneira, dois objetos, como, por exemplo, duas mitocôndrias ou dois lisossomos, serão vistos como um só objeto se eles estiverem separados por menos de 0,2 μm. Portanto, o que determina a riqueza de detalhes da imagem é o limite de resolução de um sistema óptico, e não seu poder de aumento. O aumento só tem valor prático se for acompanhado de resolução. A resolução depende essencialmente da objetiva, pois a lente ocular apenas aumenta a imagem nela projetada pela objetiva. A área de atuação da microscopia tem sido ampliada pelo uso de videocâmeras de alta sensibilidade e resolução que tomam possível a digitalização de imagens que podem ser usadas em computadores para análise quantitativa por meio de aplicativos de análise de imagem. Objetos que não são visíveis diretamente pela ocular podem ser visualizadospor uma videocâmera. Esses sistemas também são úteis para estudar células vivas por períodos longos, porque usam luz de baixa intensidade e evitam o dano celular que pode resultar de uma iluminação intensa.

Outros tipos de microscópio

Microscópio de Contraste de Fase e de Contraste Diferencial de Interferência: espécimes biológicas não corados são geralmente transparentes e difíceis de serem observados com detalhes. A microscopia de contraste de fase baseia-se no princípio de que a luz muda sua velocidade ao atravessar estruturas celulares e extracelulares que tenham índices de refração diferentes, tornando possível a observação de células vivas e cortes não corados produzindo imagens visíveis de objetos quase transparentes.

Microscópio de polarização: “polarização” é um fenômen que ocorre quando a luz passa através de certas substâncias, tais como os cristais, e é dividida de modo que emergem dos raios luminosos derivados de um só. A capacidade que estruturas têm de girar o plano de vibração da luz polarizada é chamada de birrefringência. No microscópio de polarização, a luz é polarizada embaixo da platina do microscópio por um prisma de quartzo Nicol chamado polarizador. Um segundo prisma, chamado analisador e polarizador, é ajustado de modo que os feixes luminosos tenham um trajeto paralelo e uma imagem normal pode ser vista através da ocular.
Microscópio de Fluorescência: “fluorescência” é o fenômeno que certas substâncias possuem de quando irradiadas por luz de um certo comprimento de onda (invisível) passam a emitir luz com comprimento de onda mais longo (visível). Neste tipo de microscópio, a luz ultravioleta é utilizada para iluminar as secreções de tecidos que passam a emitir luz na porção visível do espectro, fazendo com que substâncias fluorescentes apareçam brilhantes sobre um fundo escuro. O microscópio de fluorescência possui uma fonte de luz ultravioleta muito intensa e filtros especiais que selecionam o comprimento de onda dos raios luminosos que atingem o espécime e também dos raios que são emitidos pelo espécime.
Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET): este difere do MO pelo fato de usar feixes de elétrons em vez de feixe de luz. O funcionamento do MET se baseia no princípio que elétrons podem ser desviados por campos eletromagnéticos de uma maneira semelhante à refração produzida pela luz por lentes de vidro. Elétrons são liberados pelo aquecimento deum delicado filamento metálico (geralmente tungstênio) em vácuo. Os elétrons liberados por este filamento (chamado de catodo) são então submetidos a uma diferença de voltagem de 60 – 120kV existente entre o catodo e o anodo. Desta maneira, os elétrons são atraídos pelo anodo e acelerados, atingindo altas velocidades, formam feixes e percorrem o tubo do microscópio. Alguns elétrons interagem com átomos do corte ao atravessá-lo e continuam seus trajetos em direção às outras lentes, enquanto outros simplesmente cruzam o espécime sem interagir com ele. Pelo fato de a retina não ser sensível a elétrons, para se observar uma imagem, eles necessitam ser projetados sobre um detector – uma placa fluorescente, um negativo fotográfico o uma câmera CCD. Como a imagem no MET é produzida pelo balanço da quantidade de elétrons que atingiram o detector e elétrons que foram retidos no tubo do microscópio, a imagem resultante é sempre em preto-e-branco. As áreas escuras de uma micrografia eletrônica costumam ser denominadas de elétron-densas, enquanto as áreas claras são chamadas de elétron-lucentes ou elétron-transparentes.
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV): diferentemente do MET, no MEV os elétrons não atravessam o espécime, proporcionando apenas uma visão de superfície. Um feixe muito pequeno de elétrons é movido sequencialmente de modo a varrer a secção de tecido. Os elétrons interagem com uma camada muito delgada do metal previamente aplicada ao espécime e são refletidos pelos átomos do metal. Estes elétrons são capturados por um detector que os transmite a amplificadores e outros dispositivos de forma que o sinal é finalmente projetado em um tubo de raios catódicos (um monitor), resultando em uma imagem e preto-e-branco. As fotografias resultantes são de fácil interpretação, pois apresentam imagens que parecem ser iluminadas e possuem locais claros e outros sombreados. A microscopia eletrônica de varredura fornece imagem tridimensionais das superfícies de células, tecidos e órgãos.